流式细胞术是利用流体力学聚焦使细胞一个一个通过激光光路，通过对细胞通过激光时所产生的散射、折射以及激光所激发的荧光光强等信号进行记录，从而对细胞的形态、死活、代谢、周期以及表型等进行分析的技术。

流式细胞仪流程：  

样本制备→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统

流式细胞术可同时分析单个细胞中多个蛋白、基因表达以及氧化、细胞活性、细胞周期、凋亡和增殖等细胞功能。该技术通过将从单个细胞检测到的信息进行组合来获得具有统计学意义的数据量，从而深入了解异质样品。无论是鉴定细胞亚群，还是研究细胞功能，流式细胞术都有广泛地应用，对免疫功能障碍、造血系统疾病及恶性肿瘤的研究、诊断、治疗和预后评估都起到重要作用。

二、交付内容

提供数据分析报告及分析结果图片。

1.流式细胞术实验（细胞周期除外）报告一般包括：原始文件（.fcs格式）、FlowJo分析结果（.wsp格式）、FlowJo分析结果统计（.xls格式）、FlowJo分析结果代表图片和Graphpad Prism分析结果、实验报告。

2.细胞周期实验包括：原始文件（.fcs格式）、Modfit分析结果（.mlf格式）、Modfit分析结果（.tif格式）、 Graphpad Prism分析结果、实验报告。

三、测试周期

收到样品2-3周左右时间，具体周期请于艾思实验室的工作人员确认，谢谢！

四、实验步骤

样本上机前处理方式（以流式周期实验为例）

1、收集细胞：弃去上清，加入1 ml PBS清洗一次，弃上清，再加入1 ml 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。细胞悬液转入离心管中，1500 rpm离心5 min收集细胞。

2、PBS洗涤细胞：加入3 ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1500 rpm离心5 min，弃上清。沉淀震荡混匀。

3、固定过夜：沉淀中缓慢加入-20℃预冷的75％乙醇，重悬细胞，4℃过夜。

4、PBS洗涤细胞：加入2 ml PBS混匀后，1500 rpm离心5 min收集细胞，PBS重悬，离心收集细胞。加入100 ul PBS重悬细胞。

5、去除RNA：加入2 μl 浓度为1 mg/ml 的RNaseA（去离子水配制），37℃水浴40 min。

6、荧光标记：加入100 µl浓度为100 µg/ml 的PI染色液（PBS配制），避光染色20 min。

7、上机检测：流式细胞仪使用激发波长488 nm，发射波长585±21 nm进行检测，用flowj软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。

1.流式检测细胞周期

通过PI等可以与DNA结合的荧光染料对DNA进行染色，DNA含量越多，激光激发后产生的荧光越强，通过检测荧光强度对细胞处于哪个分裂阶段进行判断。

2.流式检测细胞凋亡

Annexin V 与 PI 匹配使用，可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来：PI 被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被 FITC 和 PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

3.流式检测ROS

不发光的2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA)为ROS捕获剂，可迅速通过细胞膜进入细胞，在细胞内酯酶作用下脱去二酯生成不发光的DCFH,而DCFH不能通透细胞膜。

4.流式检测线粒体膜电位

线粒体跨膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件，JC-1染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱表征线粒体内膜电负性的增高或降低。

5.免疫表型分析

表型就是某种细胞或者细胞亚群表达一些重要的抗原分子的情况，明确细胞表达这些抗原分子的情况就能从一定程度上判断这群细胞的某些特征，而且也可以从一定程度上判断这群细胞的功能状态。

【需要与细胞孵育培养】

1.块体类—薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等
送样量：该类样本处理方式建议为先铺细胞，再放材料（适用于材料轻薄）；或者浸提处理，可参考国标ISO 10993-12 2007中的浸提方式浸提，根据浸提方式按量和检测时间点提供；
制样要求：若是需要把细胞接种到材料上的话，金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形，建议制备直径为30-33 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪，默认制备直径为32 mm。

2.液体类
送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；若采用稀释后样本测试，则须告知稀释倍数及工作液浓度；若溶剂为有机溶剂（如DMSO，醇类，酚类等），最高工作液浓度中，溶剂的占比低于0.5%。

3.粉末类
送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；
①可溶性粉末：注明溶剂的种类（如无水乙醇，异丙醇，DMSO，培养基，PBS或者生盐水等），当样品对溶剂有特殊需求时，请在送样时附加所需溶剂；
②不可溶粉末：注明样本性质，灭菌方式，及分散为均匀悬浮液所需必要步骤，
如果不可使用分散液，需要预试，样本量可联系本公司人员确认。

【不需要与细胞孵育培养】

1、直接流式检测样本，寄送时避光4度低温保存，包装完整，标明分组情况和测试条件；
2、需要试剂盒染色处理样本，寄送时4度低温保存，包装完整，标明染色试剂盒和测试条件，若需要特殊染色试剂盒，请自行提供或本公司代为购买。
注：测试时，默认每组1个平行，流式上机检测3次。